Dres. Mathieu H. Soriano MD*, Sebastián G. Barreiro MD *¹
Pedro R. Miranda MD*, Nicolás G. Bazán MD. PHD*²
*¹ LSU-Neuroscience center
*² Director LSU-Neuroscience center
Hospital Oftalmológico Santa Lucía
mathieusoriano@yahoo.com
Resumen
Objetivo: el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) está expresado en la glia y en las células del epitelio pigmentario de la retina. Citoquinas y factores de crecimiento están asociados con la activación celular de función autócrina. La señal proinflamatoria inducida por interleuquina 1 (IL-1) y el estres oxidativo activan la expresión genética de este factor de crecimiento.
El objetivo de este trabajo es investigar el efecto de la IL-1 y el estrés oxidativo generado por el factor de necrosis tumoral (TNF-a) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) en la expresión del VEGF en células humanas del epitelio pigmentario de la retina (ARPE-19).
Métodos: las células ARPE-19 son transfectadas por el método DOTAP con el promotor (1.6 kb) VEGF unido a un gen de luciferasa. Despúes de 3 horas de transfección las células fueron lavadas e incubadas por otras 8 a 10 horas antes de agregarles los inductores. Las células fueron incubadas por 6 horas en un medio desprovisto de nutrientes antes de agregarles IL-1b, TNF-a y H2O2, y se incubaron durante 8 horas.
La actividad de luciferasa fue medida usando como sustrato a la luciferina. Las células apoptóticas fueron detectadas mediante el uso de un microscópio de fluorescencia confocal usando la tinción Hoechst.
Resultados: los resultados obtenidos indican que la IL-1b y el TNF-a aumentan moderadamente la expresión del VEGF en células del ARPE-19. Por otro lado la suma
del TNF-a y el H2O2 aumentan considerablemente la expresión del VEGF. La tinción Hoeschst de células transfectadas con el VEGF muestra la apoptósis celular producida por el estres oxidativo.
Conclusiones: diferentes citoquinas y el estrés oxidativo inducen la sobreexpresión del VEGF mediada por diferentes quinasas y factores nucleares en las ARPE-19. Esta expresión puede participar en la apoptosis celular de diferentes patologías retineanas como la retinopatia diabética. El estudio e identificación de esta vía celular puede ser potencialmente útil como blanco para el uso de diferentes drogas.
Introducción
Las células del epitelio pigmentario de la retina son las células fagocíticas más activas del cuerpo humano.(10)
Seleccionan, procesan y metabolizan compuestos esenciales para la función visual como la vitamina A y los ácido docosahexaenoico (13,14,16)
Tienen un rol protagónico en regular vías de señalización intercelular, expresión genética, transporte de proteínas, etc. (17)
Están involucradas en enfermedades degenerativas de la retina.
El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es un mitógeno celular específico emdotelial, que está involucrado en la angiogénesis para el crecimiento de tumores sólidos y en enfermedades de la retina1-3. Este factor de crecimiento vascular se expresa en la glia y en las células del epitelio pigmentario de la retina (4-5). Diferentes inductores como citoquinas, VEGF, y otros factores de crecimiento estan asociados con la activación celular (6-7).
La señal proinflamatoria inducida por interleuquina 1 (IL-1) y el estrés oxidativo activan la expresión genética (8,9). La activación del gen del VEGF por el factor de necrosis tumoral (TNF) más el peróxido de hidrógeno (H2O2) el TNF-a + H2O2 generan un estrés oxidativo que activa la expresión genética del VEGF la cual puede formar parte de la cascada celular y puede participar en la apoptosis y muerte de las células del epitelio pigmentario (ARPE) en diferentes enfermedades como la retinopatía diabética, proliferación viteroretinal (PVR) y la degeneración macular.
El objetivo de este trabajo es dilucidar el efecto de citoquinas y el estrés oxidativo generado por el TNF-a y el H2O2 en la expresión del VEGF en células humanas del epitelio pigmentario de la retina (ARPE-19).
La disponibilidad del promotor del VEGF unido a un gen de luciferasa hace posible la evaluación del nivel de expresión genética del VEGF al ser expuesto ante diferentes estímulos inflamatorios, a su vez nos permite determinar la importancia en la vía de transducción celular. Nosotros reportamos que la IL-1b y el TNF-a aumentan moderadamente la expresión del VEGF en células del epitelio pigmentario humano transfectadas con un gen del VEGF unido a una porción de luciferasa. Por otro lado en genes del VEGF mutados la sobreexpresión no es efectiva. En cambio si sometemos la células del epitelio pigmentario a un medio con estres oxidativo aumenta significativamente la sobreexpresión del gen.
La cotransfección con el gen del factor nuclear Kappa-Beta (NF-KB) produce a su vez un aumento de la sobrexpresión del gen (11,12).
La expresión del VEGF inhibe la apoptósis celular producida por el estrés oxidativo.
Materiales y Métodos
Cultivo celular ARPE-19: esta línea celular creció y se mantuvo en un medio DMEM-F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) e incubado a 37 ° C con un aporte constante de 5% de dióxido de carbono.
Transfección celular: Las células ARPE-19 se cultivaron en una placa de petri con 6 celdas. Al obtener una confluencia del 80% en un medio al 10% de suero fetal bovino las células fueron transfectadas con 10 ug/placa con un promotor VEGF mediante el método DOTAP (Boehringer/Mannheim) siguiendo las indicaciones de dicho laboratorio. Despúes de 4 horas de incubado a 37 ºC las células recibieron medio DMEM-12 al 10% de FBS y luego se incubaron por otras 8 a 10 horas para permitir la expresión del gen.
Inducción de las células ARPE-19: las células transfectadas fueron incubadas entre 8 a 10 horas en un medio al 0.5% de FBS previa incorporación de los inductores. Dichas células reciben IL-1b (10ng/ml), TNF-a (10ng/ml) durante 8 horas. En el experimento con peróxido de hidrógeno las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de H2O2 (0,6;1,25; 2,5 mM) durante toda la noche.
Ensayo de luciferasa: el medio que contiene citoquinas y factores de crecimiento de las células tratadas fue removido y lavado con 1ml de PBS (Buffer de sodio y potasio). Las células fueron removidas y centrifugadas a 2.500g por 20 minutos a 4 grados. El pelet celular fue resuspendido en 500 ul de un buffer de luciferasa (ALL, 0,2 mM tricine, 2mM DTT, 30mM MgSO4 y 10mM ATP). Las células fueron lisadas y las partículas celulares fueron centrifugadas a 1200g. La reacción fue iniciada mediante la inyección de 100ul de 1mM luciferina y las unidades lumínicas fueron determinadas usando un luminomedidor ALL con un intervalo de 20 segundos. El ensayo de luciferasa fue realizado por triplicado y equilibrado mediante el contenido protéico usando el kit de ensayo protéico de Bio-Rad.
Tinción de Hoechst: las células ARPE-19 fueron cargadas con 2uM de Hoechst disuelta en una solución LOCKES siguiendo el protocolo del laboratorio (Promega, Madison, Wisconsin, USA) e incubadas por 1 hora a 37° C. Luego dichas células fueron lavadas con PBS y observadas bajo un microscópio Nikon DIAPHOT 200 bajo luz ultravioleta. Las imágenes fueron capturadas utilzando una cámara Hamamatsu color chilled 3CCD y el programa photoshop 5.0.
Actividad B-Galactosidasa: el nivel de inducción de B-galactosidasa fue medido siguiendo las protocolo del laboratorio. El ensayo estandar fue realizado agregando 10-30ul de estracto celular en 300ul de buffer fosfato (ph 7,0), el cual contiene 1mM de MGCL2, 45mM de 2-Mercaptoetanol, y 10mM o- nitrofenil B-D-galactopiranosido e incubando a 37° C por 30 a 45 minutos. La reacción fue terminada agregando 500ul de 1 M NA2CO3 y la absorción fue leída a 420 nM.
Resultados
Las células ARPE-19 cultivadas en placa de 6 celdas fueron transfectadas con el gen del VEGF, mediante el método DOTAP como fue descripto en materiales y métodos. Cuatro horas más tarde a la transfección, las células fueron lavadas y recivieron medio fresco (DMEM 10% FBS) para ser incubadas por otras 10 horas a 37° C.
Al día siguiente las células fueron incubadas durante 8 horas en un medio DMEM al 5% FBS y luego se les incorporó las diferentes citoquinas e inductores por otras 8 horas. Una vez terminada la inducción las células fueron procesadas para realizar la medición de actividad de luciferasa y se obtuvieron los resultados que se observan el la tabla 1 y 2.
En la tabla 3 se puede observar la actividad Beta-galactosidasa en células ARPE-19 transfectadas con el gen VEGF. Esta prueba nos muestra el grado y nivel de transfección demostrando que en cada ensayo la transfección fue de parámetros iguales. Cada experimento se realizó por triplicado.
Mediante la tinción de Hoechst se pueden observar las células del epitelio pigmentario. Las células se colorean en un tono azulado. Las células que obtienen una coloración más intensa son aquellas que están en fase apoptótica. La expocisión de estas células ante un estrés oxidativo intenso (TNF alfa (a)+ H2O2) generan muerte celular.
Conclusiones
La inducción de las células del epitelio pigmentario de la retina mediante diferentes citoquinas modula la expresión de varios factores de crecimiento que pueden tener un rol importante en la patofisiología de enfermedades retineanas como la retinopatía diabética. El estrés oxidativo generado en el medio condiciona a la retina a producir reacciones inflamatorias que conllevan a la reparación o muerte de diferentes células.
Los factores de crecimiento vascular endotelial y los factores de crecimiento nuclear tienen un rol protagónico en el desencadenamiento de cascadas genéticas involucradas en la inflamación, daño y apoptosis celular. La manipulación y el exacto conocimiento de acción de estos genes nos ayudan a entender la patofisiología de enfermedades que pueden terminar en ceguera, y a su vez nos permiten utilizar estos genes como blanco de acción de diferentes drogas terapéuticas.
Este trabajo trata de demostrar el comportamiento del factor de crecimiento vascular endotelial ante diferentes estímulos y en diferentes condiciones de medio.
Observamos el aumento de la expresión del VEGF al someterlo ante diferentes inductores. La utilización de las citoquinas como la IL-1 y TNF-a aumenta la expresión del VEGF pero no producen un daño inflamatorio severo y muerte de las células ARPE-19 humanas. Por otro lado sometiendo esta línea celular a un medio oxidativo obtenemos un resultado similar al generado por las citoquinas. En este ensayo mostramos que si combinamos las citiquinas con peróxido de hidrógeno generamos un estrés oxidativo a la línea celular obteniendo una sobreexpresión del VEGF que genera una excesiva inflamación y lleva a la muerte de las ARPE-19. La modulación del VEGF y del NF-KB la visualizamos mediante el ensayo de luciferasa, pero si queremos ver la inflamación y muerte celular el método de elección fue la tinción de Hoechst.
Este trabajo trata de clarificar el rol que juegan estos genes vasculares y nucleares con el fin de obtener un conocimiento mayor para luego utilizarlo con un fin terapéutico.
Referencias
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